农药残留量测定法

2341 农药残留量测定法
    本方法系用气相色谱法（通则0521）和质谱法（通则 0431）测定药材、饮片及制剂中部分农药残留量。除另有规定外，按下列方法测定。
    第一法 有机氯类农药残留量测定法-色谱法
    1.9种有机氯类农药残留量测定法
    色谱条件与系统适用性试验  以（14%-氰丙基-苯基）甲基聚硅氧烷或（5%苯基）甲基聚硅氧烷为固定液的弹性石英毛细管柱（30m×0.32mm×0.25μm） ，63Ni-ECD 电子捕获检测器。进样口温度230℃，检测器温度300℃，不分流进样。程序升温：初始100℃，每分钟10℃升至220℃，每分钟8℃升至250℃，保持10分钟。理论板数按α-BHC峰计算应不低于1×106，两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。
    对照品贮备溶液的制备  精密称取六六六（BHC）（α-BHC，β-BHC，γ-BHC，δ-BHC）、滴滴涕（DDT） （p，p'-DDE，p，p'-DDD，o，p'-DDT，p，p'-DDT）及五氯硝基苯 （PCNB）农药对照品适量，用石油醚（60～90℃）分别制成每1ml约含4～5μg的溶液，即得。
    混合对照品贮备溶液的制备  精密量取上述各对照品贮备液0.5ml，置10ml量瓶中，用石油醚（60～90℃）稀释至刻度，摇匀，即得。
    混合对照品溶液的制备  精密量取上述混合对照品贮备液，用石油醚（60～90℃）制成每1L分别含0μg、1μg、5μg、 10μg、50μg、100μg、250μg的溶液，即得。
    供试品溶液的制备  药材或饮片  取供试品，粉碎成粉末（过三号筛），取约2g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加水20ml浸泡过夜，精密加丙酮40ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用丙酮补足减失的重量，再加氯化钠约6g，精密加二氯甲烷30ml，称定重量，超声15分钟，再称定重量，用二氯甲烷补足减失的重量，静置（使分层），将有机相迅速移入装有适量无水硫酸钠的100ml具塞锥形瓶中，放置4小时。精密量取35ml，于40℃水浴上减压浓缩至近干，加少量石油醚（60～90℃）如前反复操作至二氯甲烷及丙酮除净，用石油醚（60～90℃）溶解 并转移至10ml具塞刻度离心管中，加石油醚（60～90℃）精密稀释至5ml，小心加入硫酸1ml，振摇1分钟，离心（3000 转/分钟）10分钟，精密量取上清液2ml，置具刻度的浓缩瓶 （见图）中，连接旋转蒸发器，40℃下（或用氮气）将溶液浓缩至适量，精密稀释至1ml，即得。
    
    制剂  取供试品，研成细粉（蜜丸切碎，液体直接量取），精密称取适量（相当于药材2g），以下按上述供试品溶液制备法制备，即得供试品溶液。
    测定法  分别精密吸取供试品溶液和与之相对应浓度的混合对照品溶液各1μl，注入气相色谱仪，按外标法计算供试品中9种有机氯农药残留量。
    2.22种有机氯类农药残留量测定法
    色谱条件及系统适用性试验  分析柱：以50%苯基50%二甲基聚硅氧烷为固定液的弹性石英毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm），验证柱：以100%二甲基聚硅氧烷为固定液的弹性石英毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm），63Ni-ECD电子捕获检测器。进样口温度240℃，检测器温度300℃，不分流进样，流速为恒压模式（初始流速为1.3ml/min）。程序升温：初始70℃，保持1分钟，每分钟10℃升至180℃，保持5分钟，再以每分钟5℃升至220℃，最后以每分钟100℃升至280℃，保持8分钟。理论板数按α-BHC计算应不低于1×106，两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。
    对照品贮备溶液的制备  精密称取表1中农药对照品适量，用异辛烷分别制成如表1中浓度，即得。
    混合对照品贮备溶液的制备  精密量取上述对照品贮备溶液各1ml，置100ml量瓶中，用异辛烷稀释至刻度，摇匀，即得。
    混合对照品溶液的制备  分别精密量取上述混合对照品贮备溶液，用异辛烷制成每1L分别含10μg、20μg、50μg、100μg、200μg、500μg的溶液，即得（其中β-六六六、异狄氏剂、p，p'-滴滴滴、o，p'-滴滴涕每1L分别含20μg、40μg、100μg、200μg、400μg、1000μg）。
    供试品溶液的制备  取供试品，粉碎成粉末（过三号筛），取约1.5g，精密称定，置于50ml聚苯乙烯具塞离心管中，加入水10ml，混匀，放置2小时，精密加入乙腈15ml，剧烈振摇提取1分钟，再加入预先称好的无水硫酸镁4g与氯化钠1g的混合粉末，再次剧烈振摇1分钟后，离心（4000转/分钟）1分钟。精密吸取上清液10ml，40℃减压浓缩至近干，用环己烷-乙酸乙酯（1：1）混合溶液分次转移至10ml量瓶中，加环己烷-乙酸乙酯（1：1）混合溶液至刻度，摇匀，转移至预先加入1g无水硫酸钠的离心管中，振摇，放置1小时，离心（必要时滤过），取上清液5ml过凝胶渗透色谱柱（400mm×25mm，内装BIO-Beads S-X3填料；以环己烷-乙酸乙酯（1：1）混合溶液为流动相；流速为每分钟5.0ml）净化，收集18～30分钟的洗脱液，于40℃水浴减压浓缩至近干，加少量正己烷替换两次，加正己烷1ml使溶解，转移至弗罗里硅土固相萃取小柱[1000mg/6ml，用正己烷-丙酮（95：5）混合溶液10ml和正己烷10ml预洗]上，残渣用正己烷洗涤3次，每次1ml，洗液转移至同一弗罗里硅土固相萃取小柱上，再用正己烷-丙酮（95：5）混合溶液10ml洗脱，收集全部洗脱液，置氮吹仪上吹至近干，加异辛烷定容至1ml，涡旋使溶解，即得。
    测定法  分别精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液各1μl，注入气相色谱仪，按外标标准曲线法计算供试品中22种有机氯农药残留量。
    限度  除另有规定外，每1kg中药材或饮片中含总六六六（α-BHC，β-BHC，γ-BHC，δ-BHC之和）不得过0.2mg；总滴滴涕（p，p'-DDE，p，p'-DDD，o，p'-DDT，p，p'-DDT之和）不得过0.2mg；五氯硝基苯（Quintozene）不得过0.1mg；六氯苯（Hexachlorobenzene）不得过 0.1mg；七氯（Heptachlor）、顺式环氧七氯（Heptachlor-exo-epoxide）和反式环氧七氯（Heptachlor-endo-epoxide）之和不得过0.05mg；艾氏剂（Aldrin）和狄氏剂（Dieldrin）之和不得过0.05mg；异狄氏剂（Endrin）不得过0.05mg；顺式氯丹（cis-Chlordane）、反式氯丹（trans-Chlordane）和氧化氯丹（oxy-Chlordane）之和不得过0.05mg； α-硫丹（α-Endosulfan）、β-硫丹（β-Endosulfan）和硫丹硫酸盐（Endosulfan sulfate）之和不得过3mg。
    【附注】
    （1）当供试品中有农药检出时，可在验证柱中确认检出的结果，再进行定量。必要时，可用气相色谱--质谱法进行确证。
    （2）加样回收率应在70%～120%之间。
     
    第二法  有机磷类农药残留量测定法-色谱法
    色谱条件与系统适用性试验  以50%苯基50%二甲基聚硅氧烷或（5%苯基）甲基聚硅氧烷为固定液的弹性石英毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm），氮磷检测器（NPD）或火焰光度检测器（FPD）。进样口温度220℃，检测器温度300℃，不分流进样。程序升温：初始120℃，每分钟10℃升至200℃，每分钟5℃升至240℃，保持2分钟，每分钟20℃升至270℃，保持0.5分钟。理论板数按敌敢畏峰计算应不低于6000，两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。
    对照品贮备溶液的制备  精密称取对硫磷、甲基对硫磷、乐果、氧化乐果、甲胺磷、久效磷、二嗪磷、乙硫磷、马拉硫磷、杀扑磷、敌敌畏、乙酰甲胺磷农药对照品适量，用乙酸乙酯分别制成每1ml约含100μg的溶液，即得。
    混合对照品贮备溶液的制备  分别精密量取上述各对照品贮备溶液1ml，置20ml棕色量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，即得。
    混合对照品溶液的制备  精密量取上述混合对照品贮备溶液，用乙酸乙酯制成每1ml含0.1μg、0.5μg、1μg、2μg、 5μg的浓度系列，即得。
    供试品溶液的制备  药材或饮片  取供试品，粉碎成粉末（过三号筛），取约5g，精密称定，加无水硫酸钠5g，加入乙酸乙酯50～100ml，冰浴超声处理3分钟，放置，取上层液滤过，药渣加入乙酸乙酯30～50ml，冰浴超声处理2分钟，放置，滤过，合并两次滤液，用少量乙酸乙酯洗涤滤纸及残渣，与上述滤液合并。取滤液于40℃以下减压浓缩至近干，用乙酸乙酯转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度；精密吸取上述溶液1ml，置石墨化炭小柱（250mg/3ml用乙酸乙酯5ml预洗）上，用正己烷-乙酸乙酯（1：1）混合溶液5ml洗脱，收集洗脱液，置氮吹仪上浓缩至近干，加乙酸乙酯定容至1ml，涡旋使溶解，即得。
    测定法  分别精密吸取供试品溶液和与之相对应浓度的混合对照品溶液各1μl，注入气相色谱仪，按外标法计算供试品中12种有机磷农药残留量。
    第三法  拟除虫菊酯类农药残留量测定法-色谱法
    色谱条件与系统适用性试验  以（5%苯基）甲基聚硅氧烷为固定液的弹性石英毛细管柱（30m×0.32mm×0.25μm），63Ni-ECD电子捕获检测器。进样口温度270℃， 检测器温度330℃。不分流进样（或根据仪器设置最佳的分流比）。程序升温：初始160℃，保持1分钟，每分钟10℃升至278℃，保持0.5分钟，每分钟1℃升至290℃，保持5分钟。理论板数按溴氰菊酯峰计算应不低于105，两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。
    对照品贮备溶液的制备  精密称取氯氰菊酯、氰戊菊酯及溴氰菊酯农药对照品适量，用石油醚（60～90℃）分别制成每1ml约含20～25μg的溶液，即得。
    混合对照品贮备溶液的制备  精密量取上述各对照品贮备液1ml，置10ml量瓶中，用石油醚（60～90℃）稀释至刻度，摇匀，即得。
    混合对照品溶液的制备  精密量取上述混合对照品贮备液，用石油醚（60～90℃）制成每1L分别含0μg、2μg、8μg、40μg、200μg的溶液，即得。
    供试品溶液的制备  药材或饮片  取供试品，粉碎成粉末（过三号筛），取约1～2g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加石油醚（60～90℃）-丙酮（4：1）混合溶液30ml，超声处理15分钟，滤过，药渣再重复上述操作2次后，合并滤液，滤液用适量无水硫酸钠脱水后，于40～45℃减压浓缩至近干，用少量石油醚（60～90℃）反复操作至丙酮除净，残渣用适量石油醚（60～90℃）溶解，置混合小柱[从上至下依次为无水硫酸钠2g、弗罗里硅土4g、微晶纤维素1g、氧化铝1g、无水硫酸钠2g，用石油 醚（60～90℃）-乙醚（4：1）混合溶液20ml预洗]上，用石油醚（60～90℃）-乙醚（4：1）混合溶液90ml洗脱，收集洗脱液，于40～45℃减压浓缩至近干，再用石油醚 （60～90℃）3～4ml重复操作至乙醚除净，用石油醚（60～90℃）溶解并转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀， 即得。
    测定法  分别精密吸取供试品溶液和与之相对应浓度的混合对照品溶液各1μl，注入气相色谱仪，按外标法计算供试品中3种拟除虫菊酯农药残留量。
    第四法 农药多残留量测定法-质谱法
    1.气相色谱-串联质谱法
    色谱条件  以5%苯基甲基聚硅氧烷为固定液的弹性石英毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm色谱柱）。进样口温度240℃ ，不分流进样。载气为高纯氦气（He）。进样口为恒压模式，柱前压力为146kPa。程序升温：初始温度70℃，保持2分钟，先以每分钟25℃升温至150℃，再以每分钟3℃升温至200℃，最后以每分钟8℃升温至280℃，保持10分钟。
    质谱条件  以三重四极杆串联质谱仪检测；离子源为电子轰击源（EI），离子源温度230℃。碰撞气为氮气或氩气。质谱传输接口温度280℃。质谱监测模式为多反应监测（MRM），各化合物参考保留时间、监测离子对、碰撞电压 （CE）与检出限参考值见表2。为提高检测灵敏度，可根据保留时间分段监测各农药。
    
    
    
    
    
    
    
    对照品贮备溶液的制备  精密称取表2与表4中农药对照品适量，根据各农药溶解性加乙腈或甲苯分别制成每1ml含1000μg的溶液，即得（可根据具体农药的灵敏度适当调整贮备液配制的浓度）。
    内标贮备溶液的制备  取氘代莠去津和氘代倍硫磷对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并制成每1ml各含1000μg的混合溶液，即得。
    混合对照品溶液的制备  精密量取上述各对照品贮备液适量，用含0.05%醋酸的乙腈分别制成每1L含100μg和 1000μg的两种溶液，即得。
    内标溶液的制备  精密量取内标贮备溶液适量，加乙腈制成每1ml含6μg的溶液，即得。
    基质混合对照品溶液的制备  取空白基质样品3g，一式6份，同供试品溶液的制备方法处理至“置氮吹仪上于40℃水浴浓缩至约0.4ml”，分别加入混合对照品溶液 （100μg/L）50μl、 100μl，混合对照品溶液（1000μg/L）50μl、 100μl、200μl、400μl，加乙腈定容至1ml，涡旋混匀，用微孔滤膜滤过（0.22μm），取续滤液，即得系列基质混合对照品溶液。
    供试品溶液的制备  药材或饮片  取供试品，粉碎成粉末（过三号筛），取约3g，精密称定，置50ml聚苯乙烯具塞离心管中，加入1%冰醋酸溶液15ml，涡旋使药粉充分浸润，放置30分钟，精密加入乙腈15ml与内标溶液100μl，涡旋使混匀，置振荡器上剧烈振荡（500次/min）5分钟，加入无水硫酸镁与无水乙酸钠的混合粉末（4：1）7.5g，立即摇散，再置振荡器上剧烈振荡（500次/min）3分钟，于冰浴中冷却10分钟，离心（4000转/min） 5分钟，取上清液9ml，置已预先装有净化材料的分散固相萃取净化管[无水硫酸镁900mg，N-丙基乙二胺（PSA）300mg，十八烷基硅烷键合硅胶300mg，硅胶300mg，石墨化炭黑90mg]中，涡旋使充分混匀，再置振荡器上剧烈振荡（500次/min）5分钟使净化完全，离心（4000转/min） 5分钟，精密吸取上清液5ml，置氮吹仪上于40℃水浴浓缩至约0.4ml，加乙腈定容至1ml，涡旋混匀，用微孔滤膜（0.22μm）滤过，取续滤液，即得。
    测定法  精密吸取供试品溶液和基质混合对照品溶液各 1μl，注入气相色谱-串联质谱仪，按内标标准曲线法计算供试品中74种农药残留量。
    2.液相色谱-串联质谱法
    色谱条件  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长15cm，内径为3mm，粒径为3.5μm）；以0.1%甲酸（含10mmol/L甲酸铵）溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，下表3进行梯度洗脱；柱温为35℃，流速为0.4ml/min。
      
    质谱条件  以三重四极杆串联质谱仪检测；离子源为电喷雾（ESI）离子源，使用正离子扫描模式。监测模式为多反应监测（MRM），各化合物参考保留时间、监测离子对、碰撞电压（CE）和检出限参考值见表4。为提高检测灵敏度，可根据保留时间分段监测各农药。
    对照品贮备溶液的制备、内标贮备溶液的制备、混合对照品溶液的制备、内标溶液的制备、基质混合对照品溶液的制备与供试品溶液的制备  均同气相色谱-串联质谱法项下。
    测定法  分别精密吸取气相色谱-串联质谱法中的供试品溶液和基质混合对照品工作溶液各1～10μl（根据检测要求与仪器灵敏度可适当调整进样量），注入液相色谱-串联质谱仪，按内标标准曲线法计算供试品中153种农药残留量。
    【附注】（1）依据各品种项下规定的监测农药种类并参考相关农药限度规定配制对照品溶液。
    （2）空白基质样品为经检测不含待测农药的同品种样品。
    （3）加样回收率应在70%～120%之间。在方法重现性可获得的情况下，部分农药回收率可放宽至50%～130%。
    （4）进行样品测定时，如果检出色谱峰的保留时间与对照品一致，并且在扣除背景后的质谱图中，所选择的监测离子对均出现，而且所选择的监测离子对峰面积比与对照品的监测离子对峰面积比一致（相对比例>50%，允许±20%偏差；相对比例>20%～50%，允许±25%偏差；相对比例> 10%～20%，允许±30%偏差；相对比例≤10%，允许±50%偏差），则可判断样品中存在该农药。如果不能确证，选用其他监测离子对重新进样确证或选用其他检测方式的分析仪器进行确证。
    （5）气相色谱-串联质谱法测定的农药，推荐选择氘代倍硫磷作为内标；液相色谱-串联质谱法测定的农药，推荐选择氘代莠去津作为内标。
    （6）方法提供的监测离子对测定条件为推荐条件，各实验室可根据所配置仪器的具体情况作适当调整；在样品基质有测定干扰的情况下，可选用其他监测离子对。
    （7）对于特定农药或供试品，分散固相萃取净化管中净化材料的比例可作适当调整，但须进行方法学考察以确保结果准确。
    （8）在进行气相色谱-串联质谱法测定时，为进一步优化方法效能，供试品溶液最终定容的溶剂可由乙腈经溶剂替换为甲苯（经氮吹至近干加入甲苯1ml即可）。