显微鉴别法

2001 显微鉴别法
    显微鉴别法系指用显微镜对药材（饮片）切片、粉末、解离组织或表面制片及含饮片粉末的制剂中饮片的组织、细胞或内含物等特征进行鉴别的一种方法。鉴别时选择具有代表性的供试品，根据各品种鉴别项的规定制片。制剂根据不同剂型适当处理后制片。
    一、药材（饮片）显微制片
    1.横切片或纵切片制片 取供试品欲观察部位，经软化处理后，用徒手或滑走切片法，切成10～20μm的薄片，必要时可包埋后切片。选取平整的薄片置载玻片上，根据观察对象不同，滴加甘油醋酸试液、水合氯醛试液或其他试液1～2滴，盖上盖玻片。必要时滴加水合氯醛试液后，在酒精灯上加热透化，并滴加甘油乙醇试液或稀甘油，盖上盖玻片。
    2.粉末制片 供试品粉末过四或五号筛，挑取少许置载玻片上，滴加甘油醋酸试液、水合氯醛试液或其他适宜的试液，盖上盖玻片。必要时，按上法加热透化。
    3.表面制片 将供试品湿润软化后，剪取欲观察部位约4mm^2，—正一反置载玻片上，或撕取表皮，加适宜的试液或加热透化后，盖上盖玻片。
    4.解离组织制片 将供试品切成长约5mm、直径约2mm的段或厚约1mm的片，如供试品中薄壁组织占大部分。木化组织少或分散存在，采用氢氧化钾法，若供试品质地坚硬，木化组织较多或集成较大群束，采用硝铬酸法或氯酸钾法。
    （1）氢氧化钾法 将供试品置试管中，加5％氢氧化钾溶液适量，加热至用玻璃棒挤压能离散为止，倾去碱液，加水洗涤后，取少量置载玻片上，用解剖针撕开，滴加稀甘油，盖上盖玻片。
    （2）硝铬酸法 将供试品置试管中，加硝铬酸试液适量，放置至用玻璃棒挤压能离散为止，倾去酸液，加水洗涤后，照上法装片。
    （3）氯酸钾法 将供试品置试管中，加硝酸溶液（1→2）及氯酸钾少量，缓缓加热，待产生的气泡渐少时，再及时加入氯酸钾少量，以维持气泡稳定地发生，至用玻璃棒挤压能离散为止，倾去酸液，加水洗涤后，照上法装片。
    5.花粉粒与孢子制片 取花粉、花药（或小的花）、孢子或孢子囊群（干燥的供试品浸于冰醋酸中软化），用玻璃棒研碎，经纱布过滤至离心管中，离心，取沉淀加新配制的醋酐与硫酸（9：1）的混合液1～3ml，置水浴上加热2～3分钟，离心，取沉淀，用水洗涤2次，取沉淀少量置载玻片上，滴加水合氯醛试液，盖上盖玻片，或加50％甘油与1％苯酚各1～2滴，用品红甘油胶[取明胶1g，加水6ml，浸泡至溶化，再加甘油7ml，加热并轻轻搅拌至完全混匀，用纱布过滤至培养皿中，加碱性品红溶液（碱性品红0.1g，加无水乙醇600ml及樟油80ml，溶解）适量，混匀，凝固后即得]封藏。
    6.磨片制片 坚硬的动物、矿物类药，可采用磨片法制片。选取厚度1～2mm的供试材料，置粗磨石（或磨砂玻璃板）上，加适量水，用食指、中指夹住或压住材料，在磨石上往返磨砺，待两面磨平，且厚度约数百微米时，将材料移置细磨石上，加水，用软木塞压在材料上，往返磨砺至透明，用水冲洗，再用乙醇处理和甘油乙醇试液装片。
    二、含饮片粉末的制剂显微制片
    按供试品不同剂型，散剂、胶囊剂（内容物为颗粒状，应研细），可直接取适量粉末；片剂取2～3片，水丸、糊丸、水蜜丸、锭剂等（包衣者除去包衣），取数丸或1～2锭，分别置乳体中研成粉末，取适量粉末；蜜丸应将药丸切开，从切面由外至中央挑取适量样品或用水脱蜜后，吸取沉淀物少量。根据观察对象不同，分别按粉末制片法制片（1～5片）。
    三、细胞壁性质的鉴别
    1.木质化细胞壁 加间苯三酚试液1～2滴，稍放置，加盐酸1滴，因木质化程度不同，显红色或紫红色。
    2.木栓化或角质化细胞壁 加苏丹Ⅲ试液，稍放置或微热，显橘红色至红色。
    3.纤维素细胞壁 加氯化锌碘试液，或先加碘试液湿润后，稍放置，再加硫酸溶液（33→50），显蓝色或紫色。
    4.硅质化细胞壁加硫酸无变化
    四、细胞内含物性质的鉴别
    1.淀粉粒
    （1）加碘试液，显蓝色或紫色。
    （2）用甘油醋酸试液装片，置偏光显微镜下观察，未糊化的淀粉粒显偏光现象；已糊化的无偏光现象。
    2.糊粉粒
    （1）加碘试液，显棕色或黄棕色。
    （2）加硝酸汞试液，显砖红色。材料中如含有多量脂肪油，应先用乙醚或石油醚脱脂后进行试验。
    3.脂肪油、挥发油、树脂
    （1）加苏丹Ⅲ试液，显橘红色、红色或紫红色。
    （2）加90％乙醇，脂肪油和树脂不溶解（蓖麻油及巴豆油例外），挥发油则溶解。
    4.菊糖加 10％α-萘酚乙醇溶液，再加硫酸，显紫红色并溶解。
    5.黏液 加钌红试液，显红色。
    6.草酸钙结矗
    （1）加稀醋酸不溶解，加稀盐酸溶解而无气泡发生。
    （2）加硫酸溶液（1→2）逐渐溶解，片刻后析出针状硫酸钙结晶。
    7.碳酸钙结晶（钟乳体）加稀盐酸溶解，同时有气泡发生。
    8.硅质加硫酸不溶解。
    五、显微测量
    系指用目镜测微尺，在显微镜下测量细胞及细胞内含物等的大小。
    1.目镜测微尺 放在目镜筒内的一种标尺，为一个直径18～20mm的圆形玻璃片，中央刻有精确等距离的平行线刻度，常为50格或100格（图1）。
    2.载物台测微尺在特制的载玻片中央粘贴一刻有精细尺度的圆形玻片。通常将长1mm（或2mm）精确等分成100（或200）小格，每1小格长为10μm，用以标定目镜测微尺（图2）。
    
    3.目镜测微尺的标定 用以确定使用同一显微镜及特定倍数的物镜、目镜和镜筒长度时，目镜测微尺上每一格所代表的长度。
    取载物台测微尺置显微镜载物台上，在高倍物镜（或低倍物镜）下，将测微尺刻度移至视野中央。将目镜测微尺（正面向上）放人目镜镜筒内，旋转目镜，并移动载物台测微尺，使目镜测微尺的“0”刻度线与载物台测微尺的某刻度线相重合，然后再找第二条重合刻度线，根据两条重合线间两种测微尺的小格数，计算出目镜测微尺每一小格在该物镜条件下相当的长度（μm），如图3所示，目镜测微尺77个小格（0～77）与载物台测微尺的30个小格（0.7～1.0）相当，已知载物台测微尺每一小格的长度为10pm.目镜测微尺每一小格长度为：10μm×30÷77=3.8μm。
    当测定时要用不同的放大倍数时，应分别标定。
    
    4.测量方法将需测量的目的物显微制片置显微镜载物台上，用目镜测微尺测量目的物的小格数，乘以上述每一小格的微米数。通常是在高倍镜下测量，但欲测量较长的目的物，如纤维、导管、非腺毛等的长度时，需在低倍镜下测量。记录最大值与最小值（μm），允许有少量数值略高或略低于规定。