肝素生物测定法

1208 肝素生物测定法
    本法系比较肝素标准品（S）与供试品（T）延长新鲜兔血或兔、猪血浆凝结时间的作用，以测定供试品的效价。
    标准品溶液的制备 精密称取肝素标准品适量，按标示效价加灭菌注射用水溶解使成每1ml中含100单位的溶液，分装于适宜的容器内，4～8℃贮存，经验证保持活性符合要求的条件下，可在3个月内使用。
    标准品稀释液的制备 试验当日，精密量取标准品溶液，按高、中、低剂量组（dS3、dS2、dSl）用氯化钠注射液配制成3种浓度的稀释液，相邻两浓度的比值（r）应相等；调节剂量使低剂量组各管的平均凝结时间较不加肝素对照管明显延长，一般以大于1.5倍空白血浆的凝结时间为宜。高剂量组各管的平均凝结时间，用兔全血法者，以不超过60分钟为宜，其稀释液一般可制成每1ml中含肝素2～5单位，r为1：0.7左右；用血浆复钙法者，以不超过30分钟为宜，其稀释液一般可制成每1ml中含肝素0.5～1.5单位，r为1：0.85左右；用活化部分凝血活酶时间测定法（APTT法）者，一般以不超过90秒为宜，其稀释液浓度一般可制成每1ml含肝素0.4～1.7单位，r为1：0.85左右，可根据实验情况调整。
    供试品溶液与稀释液的制备 按供试品的标示量或估计效价（AT），照标准品溶液与稀释液的制备法制成高、中、低（dT3、dT2、dTl）3种浓度的稀释液。相邻两浓度之比值（r）应与标准品相等，供试品与标准品各剂量组的凝结时间应相近。
    血浆的制备 迅速收集兔或猪血置预先放有109mmol/L枸橼酸钠溶液的容器中，枸橼酸钠溶液与血液容积之比为1：9，边收集边轻轻振摇，混匀，室温下1500×g离心不少于15分钟（g为重力常数）。立即吸出血浆，并分成若干份分装于适宜容器内，低温冻结贮存。临用时置37℃±0.5℃水浴中融化，用两层纱布或快速滤纸过滤，使用过程中在4～8℃放置。血浆复钙法可使用兔或猪血浆；APTT法使用兔血浆。
    测定法
    （1）兔全血法 取管径均匀（0.8cm×3.8cm或1.0cm×7.5cm）、清洁干燥的小试管若干支，每管加入一种浓度的标准品或供试品稀释液0.1ml，每种浓度不得少于3管，各浓度的试管支数相等。取刚抽出的兔血适量，分别注入小试管内，每管0.9ml，立即混匀，避免产生气泡，并开始计算时间。将小试管置37℃士0.5℃恒温水浴中，从动物采血时起至小试管放入恒温水浴的时间不得超过3分钟，注意观察并记录各管的凝结时间。
    本法的可信限率（FL％）不得大于10％。
    （2）血浆复钙法取上述规格的小试管若干支，分别加入血浆一定量，置37℃±0.5℃恒温水浴中5～10分钟后，依次每管加入一种浓度的标准品或供试品稀释液及1％氯化钙溶液，每种浓度不得少于3管，各浓度的试管支数相等，血浆、肝素稀释液和氯化钙溶液的加入量分别为0.5ml、0.4ml和0.1ml，或0.8ml、0.1ml和0.1ml，加入1％氯化钙溶液后，立即混匀，避免产生气泡，并开始计算时间，注意观察并记录各管凝结时间。
    本法的可信限率（FL％）不得大于5％。
    （3）APTT法取血液凝固分析仪样品杯若干，每管依次加入血浆50μl、一种浓度的标准品或供试品稀释液50μl、APTT试剂50μl，混匀，应避免产生气泡。37℃±0.5℃预温180秒后，每管再加入CaCl2试剂50μl，然后立即用血液凝固分析仪测定凝结时间，即活化部分凝血活酶时间（APTT）。标准品或供试品稀释液每个浓度的测定次数不得少于3次，各浓度的测定次数应相同。测定时，血浆、标准品或供试品稀释液、APTT试剂、CaCl2试剂的加入比例和预温时间可根据仪器或试剂的说明书适当调整。测定顺序以保证标准品和供试品测定的平行性为原则，应尽量保证相同浓度的标准品和供试品稀释液的测定时间接近。
    将上述方法测得的凝结时间换算成对数，照生物检定统计法（通则1431）中的量反应平行线测定法计算效价及实验误差。
    本法的可信限率（FL％）不得大于10％。