青霉素酶及其活力测定法

1202 青霉素酶及其活力测定法
    培养基
    胨		15g	0.1％硫酸亚铁（FeSO4·7H20）溶液	0.5ml
    氯化钠		4g
    枸橼酸钠	5.88g	20％硫酸镁（MgS04·7H20）溶液		1ml
    磷酸氢二钾	4g
    甘油		50g	肉浸液		1000ml
    混合上述成分，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，分装于500ml锥形瓶内，每瓶80ml，在115℃灭菌30分钟。
    青霉素酶溶液的制备
    取蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）〔CMCC（B）63 301〕的斜面培养物，接种至上述一瓶培养基内，在25℃摇床培养18小时后，取此培养物接种至其余各瓶培养基内，每瓶接种10ml，同时每瓶加入无菌青霉素4500单位，在25℃摇床培养24小时，再加无菌青霉素2万单位，继续培养24小时，离心沉淀菌体，调节pH值至约8.5，用滤柱滤过除菌，滤液用无菌操作调pH值至近中性后，分装于适宜容器内，在10℃以下贮存，备用。
    酶活力测定
    青霉素溶液的制备 称取青霉素钠（钾）适量，用磷酸盐缓冲液（pH7.0）溶解成每1ml中含青霉素1万单位的溶液。
    青霉素酶稀释液的制备 取青霉素酶溶液，按估计单位用磷酸盐缓冲液（pH7.0）稀释成每1ml中约含青霉素酶8000～12000单位的溶液，在37℃预热。
    测定法 精密量取青霉素溶液50ml，置100ml量瓶中，预热至37℃后，精密加入已预热的青霉素酶稀释液25ml，迅速混匀，在37℃准确放置1小时，精密量取3ml，立即加至已精密量取的碘滴定液（0.005mol/L）[精密量取碘滴定液（0.05mol/L）10ml，置100ml量瓶中，用醋酸钠缓冲液（pH4.5）稀释至刻度]25ml中，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失。
    空白试验 取已预热的青霉素溶液2ml，在37℃放置1小时，精密加入上述碘滴定液（0.005mol/L）25ml，然后精密加青霉素酶稀释液1ml，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定。按下式计算：
    E=（B-A）×M×F×D×100
    式中 E为青霉素酶活力，单位/（ml·小时）；
    B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml；
    A为供试品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml；
    M为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mol/L；
    F为在相同条件下，每1ml的上述碘滴定液（0.005mol/L）相当于青霉素的效价，单位；
    D为青霉素酶溶液的稀释倍数。
    【附注】 磷酸盐缓冲液（pH7.0） 取磷酸氢二钾7.36g与磷酸二氢钾3.14g，加水使成1000ml。
    醋酸钠缓冲液（pH4.5） 取冰醋酸13.86ml，加水使成250ml；另取结晶醋酸钠27.30g，加水使成200ml，两液混合均匀。