维生素D测定法

0722 维生素D测定法
    本法系用高效液相色谱法（通则0512）测定维生素D（包括维生素D2和维生素D3，下同）及其制剂、维生素AD制剂或鱼肝油中所含维生素D及前维生素D经折算成维生素D的总量，以单位表示，每单位相当于维生素D0.025μg。
    测定应在半暗室中及避免氧化的情况下进行。
    无维生素A醇及其他杂质干扰的供试品可用第一法测定，否则应按第二法处理后测定；如果按第二法处理后，前维生素D峰仍受杂质干扰，仅有维生素D峰可以分离时，则应按第三法测定。
    第一法
    对照品贮备溶液的制备 根据各制剂中所含维生素D的成分，精密称取相应的维生素D2或D3对照品25mg，置100ml棕色量瓶中，加异辛烷80ml，避免加热，超声处理1分钟使完全溶解，用异辛烷稀释至刻度，摇匀，作为贮备溶液（1）；精密量取5ml，置50ml棕色量瓶中，用异辛烷稀释至刻度，摇匀，充氮密塞，避光，0℃以下保存，作为贮备溶液（2）。
    测定维生素D2时，应另取维生素D3对照品25mg，同法制成维生素D3对照品贮备溶液，供系统适用性试验用。
    色谱条件与系统适用性试验 用硅胶为填充剂；以正己烷-正戊醇（997：3）为流动相；检测波长为254nm。量取维生素D3对照品贮备溶液（1）5ml，置具塞玻璃容器中，通氮后密塞，置90℃水浴中加热1小时，取出，迅速冷却，加正己烷5ml，摇匀，置1cm具塞石英吸收池中，在2支8W主波长分别为254nm和365nm的紫外光灯下，将石英吸收池斜放成45°并距灯管5～6cm，照射5分钟，使溶液中含有前维生素D3、反式维生素D3、维生素D3和速甾醇D3；量取该溶液注入液相色谱仪，进样5次，记录峰面积，维生素D3峰的相对标准偏差应不大于2.0%；前维生素D3峰（与维生素D3相对保留时间约为0.5）与反式维生素D3峰（与维生素D3相对保留时间约为0.6）以及维生素D3峰与速甾醇D3峰（与维生素D3相对保留时间约为1.1）的分离度均应大于1.0。
    校正因子测定 精密量取对照品贮备溶液（2）5ml，置50ml量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，计算维生素D的校正因子f1。
    
    式中 c1为维生素D对照品溶液的浓度，μg/ml；
     A1为对照品溶液色谱图中维生素D峰的峰面积。
    另精密量取对照品贮备溶液（2）5ml，置50ml量瓶中，加2，6-二叔丁基对甲酚结晶1粒，通氮排除空气后，密塞，置90℃水浴中加热1.5小时，取出，迅速冷却，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液；取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，计算前维生素D的校正因子f2。
    
    式中 c1为f1测定项下维生素D对照品溶液的浓度，μg/ml
     f1为维生素D的校正因子；
     A1为混合对照品溶液色谱图中维生素D峰的峰面积；
     A2为混合对照品溶液色谱图中前维生素D峰的峰面积。
    测定法 取该制剂项下制备的供试品溶液进行测定，按下列公式计算维生素D及前维生素D折算成维生素D的总量（ci）。
    
    式中 Ai1为维生素D峰的峰面积；
     Ai2为前维生素D峰的峰面积。
    第二法
    供试品溶液A的制备 精密称取供试品适量（相当于维生素D总量600单位以上，重量不超过2.0g），置皂化瓶中，加乙醇30ml、维生素C0.2g与50%氢氧化钾溶液3ml[若供试量为3g，则加50%氢氧化钾溶液4ml]，置水浴上加热回流30分钟，冷却后，自冷凝管顶端加水10ml冲洗冷凝管内壁，将皂化液移至分液漏斗中，皂化瓶用水60～100ml分数次洗涤，洗液并入分液漏斗中，用不含过氧化物的乙醚振摇提取3次，第一次60ml，以后每次40ml，合并乙醚液，用水洗涤数次，每次约100ml，洗涤时应缓缓旋动，避免乳化，直至水层遇酚酞指示液不再显红色，静置，分取乙醚提取液，加入干燥滤纸条少许振摇除去乙醚提取液中残留的水分，分液漏斗及滤纸条再用少量乙醚洗涤，洗液与提取液合并，置具塞圆底烧瓶中，在水浴上低温蒸发至约5ml，再用氮气流吹干，迅速精密加入甲醇3ml，密塞，超声处理助溶后，移入离心管中，离心，取上清液作为供试品溶液A。
    净化用色谱系统分离收集维生素D 精密量取上述供试品溶液A500μl，注入以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，以甲醇-乙腈-水（50：50：2）为流动相进行分离，检测波长254nm，记录色谱图，维生素D与前维生素D应为重叠峰，并能与维生素A及其他杂质分开。准确收集含有维生素D及前维生素D混合物的全部流出液，置具塞圆底烧瓶中，用氮气流迅速吹干，精密加入正己烷溶液适量，使每1ml中含维生素D50～140单位，密塞，超声处理使溶解，即得供试品溶液B。
    测定法 取供试品溶液B，照第一法进行含量测定，进样量为100～200μl。
    第三法
    供试品溶液的制备 取该制剂项下制备的供试品溶液A，按上述第二法净化用色谱系统分离维生素D项下的方法处理，至“用氮气流迅速吹干”后，加入异辛烷2ml溶解，通氮排除空气后，密塞，置90℃水浴中，加热1.5小时后，立即通氮在2分钟内吹干，迅速精密加入正己烷2ml，溶解后，即得供试品溶液C。
    对照品溶液的制备 精密量取对照品贮备溶液（1）适量， 加异辛烷定量稀释制成每1ml中约含维生素D50单位，精密量取2ml，置具塞圆底烧瓶中，照供试品溶液制备项下的方法，自“通氮排除空气后”起，依法操作，得对照品溶液。
    测定法 照第一法项下的色谱条件，精密量取对照品溶液与供试品溶液C各200μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算维生素D的含量。