重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定法

3525 重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定法
    （NFS-60细胞/MTT比色法）
    本法系依据小鼠骨髄白血病细胞（NFS-60细胞）的生长状况因重组人粒细胞刺激因子（G-CSF）生物学活性的不同而不同，以此检测G-CSF的生物学活性。
    试剂  （1）RPMI 1640培养液  取RPMI 1640培养基粉末1袋（规格为1L），加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素105IU和链霉素105IU，再加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，保存。
    （2）基础培养液  量取新生牛血清100ml，加入RPMI 1640培养液900ml中。4℃保存。
    （3）完全培养液  基础培养液中加入重组人粒细胞刺激因子至最终浓度为每1ml含10~20ng。
    （4）PBS  称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。
    （5）噻唑蓝（MTT）溶液  称取MTT粉末0.10g，溶于PBS 20ml中，配制成每1ml含5.0mg的溶液，，经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。
    （6）裂解液  量取盐酸14ml、Triton X-100溶液50ml，加异丙醇，配制成500ml的溶液。室温避光保存。
    标准品溶液的制备  取重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定标准品，按说明书复溶后，用基础培养液稀释至 每1ml含50~300IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔，每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
    供试品溶液的制备  将供试品按标示量复溶后，用基础培养液稀释成每1ml含50~300IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔，每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
    测定法  NFS-60细胞株用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×105~4.0×105个细胞，传代后24~36小时用于生物学活性测定。将试验所用溶液预温至37℃。取足量NFS-60细胞培养物，离心收集NFS-60细胞，用RPMI 1640培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液配成每1ml含2.0×105个细胞的细胞悬液，置37℃备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液50μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养40~48小时。每孔加入MTT溶液20μl，于37℃、二氧化碳条件下培养5小时。以上操作在无菌条件下进行。每孔加入裂解液100μl，混匀后，放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
    试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算结果：
                                  Ds×Es    
    供试品生物学活性（IU/ml）=Pr× ———————
                                   Dr×Er
    式中  Pr为标准品生物学活性，IU/ml；
    Ds为供试品预稀释倍数；
    Dr为标准品预稀释倍数；
    Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
    Er为标准品半效量的稀释倍数。
    注：显色方法也可采用经等效验证的其他显色方法。