干扰素生物学活性测定法

3523 干扰素生物学活性测定法
    第一法  细胞病变抑制法
    本法系依据干扰素可以保护人羊膜细胞（WISH）免受水泡性口炎病毒（VSV）破坏的作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染色，在波长570nm处测定其吸光度，可得到干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此测定干扰素生物学活性。
    试剂  （1）MEM或RPMI 1640培养液  取MEM或RPMI 1640培养基粉末1袋（规格为1L），加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素105IU和链霉素105IU，再加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。
    （2）完全培养液  量取新生牛血清10ml，加MEM或RPMI 1640培养液90ml。4℃保存。
    （3）测定培养液  量取新生牛血清7ml，加MEM或RPMI 1640培养液93ml。4℃保存。
    （4）攻毒培养液  量取新生牛血清3ml，加MEM或RPMI 1640培养液97ml。4℃保存。
    （5）消化液  称取乙二胺四乙酸二钠0.2g、氯化钠8.0g，氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.152g、磷酸二氢钾0.2g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。
    （6）染色液  称取结晶紫50mg，加无水乙醇20ml溶解后，加水稀释至100ml，即得。
    （7）脱色液  量取无水乙醇50ml、醋酸0.1ml，加水稀释至100ml。
    （8）PBS  称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。
    标准品溶液的制备  取人干扰素生物学活性测定的国家标准品，按说明书复溶后，用测定培养液稀释至每1ml含1000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。
    供试品溶液的制备  将供试品按标示量溶解后，用测定培养液稀释成每1ml约含1000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。
    测定法  使WISH细胞在培养基中贴壁生长。按（1：2）~（1：4）传代，每周2~3次，于完全培养液中生长。取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗2次后消化和收集细胞，用完全培养液配制成每1ml含2.5×105~3.5×105个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养4~6小时；将配制完成的标准品溶液和供试品溶液移人接种WISH细胞的培养板中，每孔加入100μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养18~24小时；弃去细胞培养板中的上清液，将保存的水泡性口炎病毒（VSV，-70℃保存）用攻毒培养液稀释至约100CCID50，每孔100μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养24小时（镜检标准品溶液的50%病变点在1IU/ml）；然后弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入染色液50μl，室温放置30分钟后，用流水小心冲去染色液，并吸干残留水分，每孔加入脱色液100μl，室温放置3~5分钟。混匀后，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
    试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算结果：
                                  Ds×Es    
    供试品生物学活性（IU/ml）=Pr× ———————
                                   Dr×Er
    式中  Pr为标准品生物学活性，IU/ml；
    Ds为供试品预稀释倍数；
    Dr为标准品预稀释倍数；
    Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
    Er为标准品半效量的稀释倍数。
    注：显色方法也可采用经等效验证的其他显色方法。
    第二法  报告基因法（适用于Ⅰ型干扰素）
    本法系将含有干扰素刺激反应元件和荧光素酶基因的质粒转染到HEK293细胞中，构建细胞系HEK293puroISRE-Luc，作为生物学活性测定细胞，当Ⅰ型干扰素与细胞膜上的受体结合后，通过信号转导，激活干扰素刺激反应元件，启动荧光素酶的表达，表达量与干扰素的生物学活性成正相关，加入细胞裂解液和荧光素酶底物后，测定其发光强度，以此测定I型干扰素生物学活性。
    试剂  （1）完全培养液  MEM培养液，含有2mmol/L的L-谷氨酰胺，1mmol/L的丙酮酸钠，0.01mg/L的非必需氨基酸，2μg/ml的嘌呤霉素，100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素，10%的胎牛血清。4℃保存。
    （2）测定培养液  除不含嘌呤霉素外，其他成分与完全培养液相同。4℃保存。
    （3）PBS  取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。
    （4）消化液  称取乙二胺四乙酸二钠0.2g、胰酶2.5g，用PBS溶解并稀释至1000ml，除菌过滤。4℃保存。
    （5）荧光素酶报告基因检测试剂盒  包括细胞裂解液、荧光素酶底物等。
    标准品溶液的制备  取重组人干扰素生物学活性测定国家标准品，按说明书复溶后，用测定培养液稀释至每1ml约含10000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。
    供试品溶液的制备  将供试品按标示量溶解后，用测定培养液稀释成每1ml约含10000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。
    测定法  使HEK293puroISRE-Luc细胞在完全培养液中贴壁生长。按1：4传代，每周2~3次，于完全培养液中生长。取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗1次后消化和收集细胞，用测定培养液配制成每1ml含3.5×105~4.5×105个细胞的细胞悬液。将配制完成的标准品溶液和供试品溶液移入可用于细胞培养和化学发光酶标仪测定的96孔细胞培养板中，每孔加入100μl，然后将上述细胞悬液接种于同一96孔细胞培养板中，每孔100μl。于37℃、5%二氧化碳条件下培养18~24小时。小心吸净96孔细胞培养板中的上清液，按荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书加入细胞裂解液和荧光素酶底物，用化学发光酶标仪测定发光强度，记录测定结果。
    试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算试验结果：
                                  Ds×Es    
    供试品生物学活性（IU/ml）=Pr× ———————
                                   Dr×Er
    式中  Pr为标准品生物学活性，IU/ml；
    Ds为供试品预稀释倍数；
    Dr为标准品预稀释倍数；
    Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
    Er为标准品半效量的稀释倍数。