A群脑膜炎球菌多糖分子大小测定法

3419 A群脑膜炎球菌多糖分子大小测定法
    第一法  测磷法（仲裁法）
    本法用于测定细菌荚膜多糖在色谱中的分配系数（KD）和多糖在规定（KD）值以前的回收率。
    试剂  （1）流动相  称取氯化钠11.7g、叠氮钠0.1g，加水溶解成1000ml，混匀，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至7.0。
    （2）蓝色葡聚糖2000溶液  称取蓝色葡聚糖2000 20mg，加流动相溶解成10ml。
    （3）维生素B12溶液  称取10mg维生素B12，加流动相溶解成10ml。
    色谱柱的制备  取琼脂糖4B凝胶或琼脂糖CL-4B凝胶约200ml，加动相400ml充分搅拌，放置约1小时使其沉淀，倾去上层含悬浮颗粒的悬液。如此反复3~5次后，加流动相200ml，混匀，抽去凝胶中的空气，装于1.5cmX90cm色谱柱中，约87cm高，用流动相洗脱，流速为每小时15~20ml，以2~3倍柱床体积的流动相洗脱（约500ml），使柱床平衡。
    色谱柱的标定  取蓝色葡聚糖2000溶液1ml，加至已平衡的色谱中，以流动相洗脱，流速每小时15~20ml，用组分收集器收集洗脱液，每管收集3~5ml，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在波长260nm处测定各洗脱液的吸光度，以吸光度为纵坐标，洗脱液体积（ml）为横坐标分别作图，波长260nm处峰顶洗脱液体积为空体积V0。
    量取维生素B12溶液1ml，自“加至已平衡的色谱柱中”起，同法操作，370nm波长处峰顶洗脱液体积为柱床体积V1。
    测定法  取供试品约1ml（含多糖抗原3~5mg，如为冻干制品可用流动相溶解〉，加至已标定的色谱柱中，用流动相洗脱，用组分收集器收集洗脱液，每管收集5ml，照磷测定法（通则3103）测定洗脱液的磷含量。以供试品每管洗脱液的磷含量为纵坐标，洗脱液体积（ml）为横坐标作图，主峰峰顶洗脱液体积为Ve。
    按下式计算：
                Ve —V0
            KD=————————
                 V1—V0
    式中  KD为供试品分配系数；
          Ve为供试品洗脱液体积，ml；
          V0为空流体积，ml；
          V1为柱床体积，ml；
    计算供试品在KD值<0.5的多糖回收率：
                     Ax
           Rx（%）=——————×100
                     At
    式中  Rx为KD值<0.5供试品的多糖回收率，％；
          Ax为供试品在KD值<0.5各管洗脱液的磷含量之和；
          At为供试品所有管洗脱液的磷含量之和。
    第二法  仪器法
    试剂与色谱柱的制备第一法。
    色谱柱的标定  量取蓝色葡聚糖2000溶液1ml与维生素B12溶液0.2ml，混匀后加至已平衡的色谱柱中，以流动相洗脱，流速每小时15~20ml，检测波长206nm，用组分收集器收集洗脱液，记录色谱图，色谱图中，第一峰为蓝色葡聚糖2000峰，峰顶的洗脱液体积为空流体积V0；第二峰为维生素B12峰，峰顶的洗脱液体积为柱床体积V1。
    测定法  取供试品约1ml（含多糖抗原3~5mg，如为冻干制品可用流动相溶解），加至已标定的色谱柱中，用流动相洗脱，流速为每小时15~20ml，检测波长206nm，用组分收集器收集洗脱液，记录色谱图，即得。
    按下式计算
                Ve —V0
            KD=————————
                 V1—V0
    式中  KD为供试品分配系数；
          Ve为供试品洗脱液体积，ml；
          V0为空流体积，ml；
          V1为柱床体积，ml；
    计算供试品在KD值<0.5的多糖回收率：
                     Ax
           Rx（%）=——————×100
                     At
    式中  Rx为KD值<0.5供试品的多糖回收率，％；
          Ax为供试品在KD值<0.5的色谱图面积；
          At为供试品色谱图总面积。
    【附注】过柱操作在10~20℃进行。