假单胞菌菌体蛋白质残留量测定法

3413 假单胞菌菌体蛋白质残留量测定法
    本法系采用酶联免疫法测定假单胞菌表达系统生产的重组制品菌体蛋白质残留量。
    试剂  （1）包被液（pH9.6碳酸盐缓冲液） 精密称取碳酸钠0.32g、碳酸氢钠0.586g，置200ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。
    （2）磷酸盐缓冲液 称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，置500ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，121℃灭菌15分钟。
    （3）洗涤液  量取聚山梨酯20 0.5ml，加磷酸盐缓冲液稀释至500ml。
    （4）浓稀释液 称取牛血清白蛋白1.0g，加洗涤液溶解并稀释至100ml。
    （5）稀释液  浓稀释液与水等体积混合。
    （6）底物缓冲液（0.005mol/L醋酸钠-枸橼酸缓冲液）  称取醋酸钠0.68g、枸橼酸（C6H8O7•H2O）1.05g，加水溶解并稀释至1000ml，调pH值至3.6。
    （7）底物液A 称取3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB）0.08g，加二甲基亚砜40ml溶解，加甲醇60ml，混匀，加底物缓冲液100ml，避光搅拌2小时至完全溶解，室温静置4小时。
    （8）底物液B 量1.5%过氧化氢溶液3.2ml，加底物缓冲液至1000mL。
    （9）底物液  临用前取底物液A、B等体积混合。
    （10）终止液 2mol/L硫酸溶液。
    标准品溶液的制备  按试剂盒使用说明书用稀释液溶解菌体蛋白质标准品，精密量取适量，用稀释液稀释成1ml中含菌体蛋白质20ng、10ng、5ng、2.5ng、1.2ng、0.6ng、0.3ng的溶液。
    供试品溶液的制备  取供试品适量，用稀释液稀释成每1ml中约含蛋白质100μg的溶液，如供试品1ml中含蛋白质量小于200μg时，用浓稀释液将供试品稀释1倍。
    测定法 取包被抗体，用包被液稀释至适宜的浓度（稀释倍见试剂盒说明书），以100μl/孔加至96孔酶标板内，在2~8℃放置16~20小时；用洗涤液洗3次；用洗涤液制备1%牛血白蛋白溶液，以200μl/孔加至酶标板内，置室温荡（每分钟200~300转）1小时，用洗涤液洗板3次；以100μl/孔加入标准品溶液和供试品溶液，每个稀释度做双孔，同时加入2孔空白对照（稀释液），置室温振荡（每分钟200~300转）1小时；用洗涤液洗板3次；按试剂盒说明书用稀释液稀释一抗至适宜浓度，以100μl/孔加至酶标板内，置室温振荡（每分钟200~300转）1小时；用洗涤液洗板3次；然后按试剂盒说明书用稀释液稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗至适宜的浓度，以100μl/孔加至酶标板内，置室温振荡（每分钟200~300转）30分钟，用洗涤液洗板8次；以100μl/孔加入底物液，置室温避光反应10~15分钟，以100μl/孔加入终止液终止反应，用酶标仪在波长450nm处测定吸光度，用计算机分析软件进行读数和数据分析，也可使用手工作图法计算。
    以标准品溶液吸光度对其相应的浓度作标准曲线，并以供试品溶液吸光度在标准曲线得到相应菌体蛋白质含量，按以下公式计算：
                                   c×n
    供试品菌体蛋白质残留量（％）=————————×100           
                                  T×106
    式中  c为供试品溶液中菌体蛋白质量，ng/ml；
          n为供试品稀释倍数；
          T为供试品蛋白质含量，mg/ml。
    注：也可采用经验证的联免疫试剂盒进行测定。