大肠杆菌菌体蛋白质残留量测定法

3412 大肠杆菌菌体蛋白质残留量测定法
    本法系采用酶联免疫法测定大肠杆菌表达系统产生的重组制品中菌体蛋白质残留量。
    试剂 （1）包被液（pH9.6碳酸盐缓冲液）  称取碳酸钠0.32g、碳酸氢钠0.586g，置200ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。
    （2）磷酸盐缓冲液（pH7.4）  称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至500ml，121℃灭菌15分钟。
    （3）洗涤液（pH7.4）  量取聚山梨酯20 0.5ml，加磷酸盐缓冲液至500ml。
    （4）稀释液（pH7.4）  称取牛血清白蛋白0.5g，加洗涤液溶并稀释至100ml。
    （5）浓稀释液  称取牛血清白蛋白1.0g，加洗涤液溶并稀释至100ml。
    （6）底物缓冲液（pH5.0枸橼酸-磷酸盐缓冲液）  称取磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）1.84g、枸橼酸0.51g，加水溶解并稀释至100ml。
    （7）底物液  取邻苯二胺8mg、30%过氧化氢30μl，溶于底物缓冲液20ml中，临用时现配。
    （8）终止液  1mol/L硫酸溶液。
    标准品溶液的制备  按菌体蛋白质标准品说明书加水复溶，精密量取适量，用稀释液稀释成每1ml中含菌体蛋白质500ng、250ng、125ng、62.5ng、31.25ng、15.625ng、7.8125ng的溶液。
    供试品溶液的制备  称取供试品适量，用稀释液稀释成每1ml中约含250μg的溶液。如供试品每1ml中含量小于500μg时，用浓稀释液稀释1倍。
    测定法  取兔抗大肠杆菌菌体蛋白质抗体适量，用包被液溶解并稀释成每1ml中含10μg的溶液，以100μl/孔加至96孔酶标板内，4℃放置过夜（16~18小时）。用洗涤液洗板3次；用洗涤液制备1%牛血白蛋白溶液，以200μl/孔加至酶标板内，37℃放置2小时；将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3次；以100μl/孔加入标准品溶液和供试品溶液，每个稀释度做双孔，同时加入2孔空白对照（稀释液），37℃放置2小时；用稀释液稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白质抗体1000倍，以100μl/孔加至酶标板内，37℃置1小时，用洗涤液洗板10次，以100μl/孔加入底物液，37℃避光放置.40分钟，以50μl/孔加入终止液终止反应。用酶标仪在波长492nm处测定吸光度，用计算机分析软件进行读数和数据分析，也可使用手工作图法计算。
    以标准品溶液吸光度对其相应的浓度作标准曲线，并以供试品溶液吸光度在标准曲线得到相应菌体蛋白质含量，按以下公式计算：
                                   c×n
    供试品菌体蛋白质残留量（％）=————————×100           
                                  T×106
    式中  c为供试品溶液中菌体蛋白质量，ng/ml；
          n为供试品稀释倍数；
          T为供试品蛋白质含量，mg/ml。
    注：也可采用经验证的联免疫试剂盒进行测定。